传说用耶稣在最后的晚餐中用到的圣杯喝水，便能长生不老。在一次掘金活动中，记载圣杯的碑石被发现，圣杯存在的可能吸引着大批的疯狂的人展开寻找。印第安纳琼斯博士也是他们中的一员，甚至连他的父亲老琼斯也陷入其中——但他给琼斯留下圣杯的笔记后便不知所踪。踏上威尼斯的土地，琼斯和事先约好的史奈达博士会面，他们在图书馆里凭线索找到圣盾后，却开始遭到莫名的来自十字剑兄弟的追杀。一番波折后，琼斯终于找到了老琼斯，同时，史奈达的纳粹身份暴露，笔记被抢走。圣杯随时都有可能落入纳粹的手中。于是，琼斯父子俩开始联袂上演拯救圣杯的精彩大戏！

二战期间，希特勒在世界各地召集考古学家寻找“失落的约柜”——圣经中引导希伯来人与上帝交流的圣物，希特勒欲借其来护佑纳粹的战争。为了使希特勒的计划破灭，印第安纳琼斯博士奔赴尼泊尔，一边奋力挖掘蛛丝马迹，一边还要与无孔不入的纳粹分子周旋。凭借着过人的智慧和异于常人的胆量及大无畏的勇气，琼斯终于在罗马找到了指示约柜位置的太阳手杖，继而发现了约柜。就在大功告成之际，纳粹军却侵吞了胜利果实，还将琼斯等人留在了蛇穴里！但是无往不胜的琼斯总是有办法死里逃生，并狠狠地还以颜色！